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基于Cellar的交互式单细胞数据分析

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对于所有类型的高通量单细胞数据,细胞类型分配(cell type assignment)是一个主要挑战。在许多情况下,这种分配需要反复手动使用外部和补充数据源。为了提高跨合作、平台的统一分配细胞类型的能力,我们开发了Cellar,这是一种软件工具,为分配和数据集比较过程中涉及的所有不同步骤提供交互式支持。我们将讨论Cellar实现的不同方法,如何将这些方法用于不同的数据类型,如何组合互补的数据类型,以及如何分析和可视化数据。我们通过使用Cellar注释来自多组学单细胞测序和空间蛋白质组学研究的几个HuBMAP数据集,展示了Cellar的优势。Cellar是开源的,包括几个带注释的HuBMAP数据集。

 

包括人类生物分子图谱计划(HuBMAP,Human BioMolecular Atlas Program)在内的许多大型团队都专注于在单细胞水平上分析组织、器官和整个人体。这些团队使用几种不同的技术来研究单细胞的分子组成,包括单细胞RNA测序、单细胞ATAC测序、单细胞空间转录组学和单细胞空间蛋白质组学。除了这些大型团队,个别实验室还使用部分或全部这些模式生成数据。

 

在过去几年中,已经开发了许多方法来分配单细胞数据中的细胞类型。在大多数情况下,来自同一团队的不同小组,甚至在处理多种类型的单细胞数据时,同一小组,都依赖于不同的工具集。这使得整合和比较这些小组的数据变得困难,因为研究人员经常使用不同的分配技术、markers,甚至细胞类型的命名约定。( 目前对单细胞数据的管理缺乏一个统一 )

 

为了实现跨越不同单细胞组学平台和模式的大规模合作、集成和比较,我们开发了Cellar,这是一个交互式和图形化的细胞类型分配的web服务。 Cellar实现了一套全面的方法,包括现有的方法和新的方法,涵盖了细胞类型分配过程中涉及的所有步骤 。这些方法包括降维(dimensionality reduction)和表示(representation)、聚类(clustering)、基于参考的比对(reference-based alignment)、差异表达基因的识别(identification of differentially expressed genes)、功能集和标记集的交叉(intersection with functional and marker sets)、管理会话和输出结果的工具(tools for managing sessions and exporting results),以及同时分析和比较两个数据集的双重模式(dual mode for analyzing and comparing two datasets simultaneously)。由于细胞类型分配通常需要用户以领域知识的形式输入,Cellar采用半自动解决方案,允许用户根据自身需要去干预和修改每个处理步骤。为了实现这种交互式分析,Cellar提供了在空间单细胞图像(spatial single-cell images)中进行半监督聚类(semi-supervised clustering)和表达簇投影(projection of expression clusters)的方法。图1概述了Cellar的工作流程。过去一年,HuBMAP的成员对Cellar进行了测试,并将其用于注释来自不同器官、平台和模式的多个单细胞数据集。

图1:Cellar的工作流程。a–c为预处理(可选):Cellar可以根据表达的基因过滤细胞,根据很少表达的基因的数量过滤基因。接下来,输入被normalization。d和e:降维和可视化。作为Cellar的一部分,实现了几种降维方法。然后,通过运行另一种(可能是相同的)降维方法,将降维后的数据可视化。f–i为聚类:Cell支持几种无监督和半监督聚类方法。它还实现了有监督的 label transfer 方法。j–l为细胞类型分配:Cellar支持使用多个功能注释数据库(functional annotation databases)来分配细胞类型。

Analysis of scRNA-seq data

 

我们使用Cellar分析了11个HuBMAP的seq数据集(10x genomics),平均有来自5个不同组织(肾脏、心脏、脾脏、胸腺、淋巴结)的7500个细胞,所有这些都可以在Cellar中获得。Cellar首先通过去除不可靠的细胞和低计数基因来进行质量控制。根据用户标准应用额外的normalization和缩放scaling。然后,Cellar对数据的低维表示进行聚类,并为可视化进一步降低维度。我们通过分析含有5273个细胞的脾脏数据集(Cellar ID:HBMP3spleen-CC2)来证明这一基本pipeline。我们使用PCA,然后使用UMAP进行降维,使用Leiden算法进行聚类,得到总共16个簇(补充图1a)。

补充图1a

对于每一个簇,Cellar都识别出了top差异基因(top differential genes)。使用前500个差异基因,functional enrichment analysis 功能富集分析(GO、KEGG、MSigDB)将簇0确定为B细胞(例如,“B-Cell Activation”( q q q value=0)和“B-Cell Receptor Signaling Pathway”( q q q value=0)分别是GO和KEGG的前两类)。通过可视化两种已知B细胞 markers CD79A和TNFRSF13C的同时表达,进一步支持了这一任务。

 

功能富集分析就是把一个基因列表中,具有相似功能的基因放到一起,并和生物学表型关联起来;

 

GO与KEGG

 

为了解决将基因按照功能进行分类的问题,科学家们开发了很多基因功能注释数据库。其中比较有名的就是Gene Ontology(基因本体论,GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(京都基因与基因组百科全书,KEGG)。

 

其中,GO是基因本体论联合会建立的一个数据库,旨在建立一个适用于各种物种的、对基因和蛋白功能进行限定和描述的,并能随着研究不断深入而更新的语义词汇标准。GO注释分为三大类,分别是:分子生物学功能(Molecular Function,MF)、生物学过程(Biological Process,BP)和细胞学组分(Cellular Components,CC),通过这三个功能大类,对一个基因的功能进行多方面的限定和描述。

 

而KEGG,大多数听说过KEGG的人都会把它当做一个基因通路(Pathway)的数据库,其实功能远不止于此。KEGG是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库。KEGG下属4个大类和17和子数据库,而其中有一个数据库叫做KEGG Pathway,专门存储不同物种中基因通路的信息,也是用的最多的一个,所以,久而久之,KEGG就被大家当做是一个通路数据库了。

 

除了无监督聚类外,Cellar还实现了基于参考数据集的有监督分配方法。这些可以直接利用双模式和在Cellar中实现的其他方法。例如,这种形式的分配可以与Cell的半监督聚类选项结合使用,以纠正标签转移过程中的噪声。为了说明这种用法,我们应用Scanpy的 Ingest function(可在Cellar中使用)来集成两个专家注释的脾脏数据集(Cellar ID:HBMP2-Splege-2和HBMP3-Splege-CC3)。我们使用HBMP3-CC3作为GT,并将标签从它转移到HBMP2-2。然后,我们将标签转移的结果与HBMP2-2的GT注释进行比较,并观察到调整后的 rand score(ARI)为0.39。相比之下,在HBMP2-2上运行Leiden会导致更低的ARI分数0.27。然后,我们使用Leiden的半监督自适应算法来改进标签转移的结果,其中选择噪声最小的簇作为约束,并且在算法迭代期间不允许改变。这导致了更好的ARI得分0.66,证明了标签转移和半监督聚类的好处。这些结果如补充图2所示。

补充图2:a:HBMP2-2脾脏数据集的GT注释。b:使用默认参数(ARI:0.27)运行vanilla Leiden后的簇分配。c:使用Scanpy Ingest(ARI:0.39)从HBMP3-CC3传播标签。在运行半监督Leiden之后,在从c(ARI:0.66)传输的标签上使用默认参数进行d里的簇分配。

Analysis of scATAC-seq data

 

虽然scRNA-Seq是目前使用最广泛的数据模式,但其他几种分子数据类型也在单细胞水平上进行分析。为了说明Cellar对此类数据的使用,我们使用它来注释scATACseq。Cellar可以通过两种不同的方式处理scATAC-seq数据:cell-by-gene和cell-by-cistopic。前者基于与所有基因附近区域相关的开放染色质可及性,而后者则依赖于顺式Topic,它使用潜在的Dirichlet分配来模拟顺式调节。生成的逐基因细胞或逐细胞顺题矩阵用于下游分析,如可视化和聚类。我们使用Cellar对scATAC-seq数据集进行注释,该数据集使用逐基因表示法分析外周血单个核细胞(Cellar ID:PBMC 10k Cell-By-Gene)。结果如补充图3所示。对簇0和簇4的DE分析确定了自然杀伤(NK)细胞的KLRD1 marker。

补充图3:b是KLRD1标记基因的表达水平。该基因是自然杀伤(NK)细胞的已知标记,在簇0和簇4中高度表达。

Analysis of spatial transcriptomics data (CODEX)

 

除了测序分析,最近的成像分析还可以提供单细胞水平上基因或蛋白质表达的信息。Cellar可以通过提供表达式簇和空间组织的并排视图来分析此类数据。为了说明这一点,我们分析CO-Detection by indEXing (CODEX)空间蛋白质组学数据。我们使用了一个包含46840个细胞的淋巴结数据集(Cellar ID:19-003 lymph node淋巴结R2)。聚类结果如图2所示,以及带有投影聚类注释的这些细胞的对应图块。鉴于该数据集中分析的蛋白质数量较少(19),并非所有的聚类都可以被分配到唯一的类型,尽管有几个聚类是基于Cellar中的DE基因分析分配的。Cellar将聚类和空间图像中的细胞颜色匹配起来,从而更容易识别特定的组织及其与分析细胞类型的关系。图2中的空间图显示B细胞紧密地聚集在一起,并被T细胞和淋巴中的其他细胞类型包围。B细胞簇也包含增殖细胞(proliferating cells)。

图2:a:lymph node CODEX数据集的UMAP可视化表示,包含46840个细胞,通过leiden聚类。b:在 spatial CODEX image上的分配投影,可在Cellar中并排显示。簇分配是从a复制的。考虑到只测量了几十个蛋白质水平,并不是所有的聚类都能被分配到唯一的细胞类型,尽管有几个聚类是根据Cellar中的差异基因分析分配的。淋巴中的B细胞簇被T细胞和其他类型的细胞包围。B细胞簇也包含增殖细胞(proliferating cells)。

Joint analysis of multiple modalities

 

最后,我们使用Cellar联合分析来自两种不同模式的数据。为此,我们使用了SNARE-seq肾脏数据集,该数据集对31758个细胞的转录组和染色质可及性进行了分析(Cellar ID: kidney SNARE ATAC/RNA 20201005)。在这里,我们首先在染色质形态上运行cisTopic,并通过在推断的cis调节主题上运行Leiden来确定簇分配(图3a)。我们使用这些标签来可视化图3b中的表达数据。这可以通过Cellar的双模式(dual mode)轻松实现,该模式允许基于细胞ID的标签从一种模式转移到另一种模式。Cellar鉴定了差异基因,我们用这些基因来绘制细胞类型图。例如,根据已知标记(SLC5A12, p p p value=0)和GO term analysis(“Apical Plasma Membrane”, p p p value=1e-4)分配簇1,这表明存在近端小管细胞(Proximal Tubule Cells)。

图3:a:肾脏SNAREseq数据集31758个细胞染色质形态的UMAP图。首先,我们通过运行cistopic获得一个由cistopic矩阵生成的单元,然后通过Leiden聚类定义聚类。b:表达矩阵(expression matrix)的相应UMAP图,以及从(图a)Cellar的双模式复制的集群分配,允许基于细胞ID的标签从一种模式转移到另一种模式。

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